PEMBAHASAN PRAKTIKUM PENETAPAN KADAR ASAM AMINO DENGAN METODE LOWRY

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk menetapkan kadar protein dengan metode lowry. Protein merupakan senyawa organic kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptide. Molekul protein mengandung karbon, hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta forfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Sementara itu, analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV (Apriyantono dkk 1989).

Metode titrasi formol merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui kadar protein dalam suatu bahan. Titrasi formol hanya tepat digunakan untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan jenis protein. Metode titrasi formol ini secara ekonomis murah, cepat dan tidak memerlukan keahlian khusus, walaupun metode ini termasuk dalam metode yang konvesional.

Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu²⁺ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh spektrofotometer maka semakin tinggi pula kandungan protein yang terdapat dalam zat tersebut. Keuntungan dari metode biuret ini adalah bahan yang digunakan relative murah akan tetapi kelemahan dari metode ini adalah sensitivitas terhadap bahan yang diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan dalam jumlah yang tidak sedikit.

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu⁺ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat, menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lowry dkk 1951).

Dalam praktikum ini penetapan kadar protein dilakukan dengan metode lowry. Protein standar yang digunakan adalah BSA (Bovine Serum Albumin) atau albumin serum sapi. Albumin merupakan salah satu jenis protein globuler yang larut dalam air dan terkoagulasi oleh panas (Winarno, 1989). BSA dalam praktikum ini berfungsi untuk membuat kurva standar. BSA digunakan karena stabilitas untuk meningkatkan sinyal dalam tes, kurangnya efek dalam reaksi biokimia, dan biaya rendah, karena jumlah besar maka dapat segera dimurnikan dari darah sapi, produk sampingan dari industri ternak.

Reagen yang digunakan dalam uji lowry salah satunya adalah reagen Folin Ciocalteu. Folin-Ciocalteu merupakan pereaksi kompleks yang berisi fosfomolibdat dan fosfotungstat. Fungsi dari reagen ini adalah membentuk kompleks warna biru yang disebabkan dari reaksi antara tirosin yang ada dalam protein dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat.

Hal pertama yang dilakukan dalam praktikum ini adalah pembuatan kurva baku dengan seri kadar 100mcg/ml – 600mcg/ml. Fungsi dari pembuatan kurva baku ini adalah untuk membuat persamaan kurva baku y = Bx + A. Setelah itu sample x, y dan z yang sudah disediakan dipipet sebanyak 0,6 ml kemudian ditambahkan dengan 3 ml reagen C dan didiamkan selama 15 menit pada suhu kamar, tujuannya adalah agar protein dan reagen dapat tercampur sempurna. Selanjutnya ditambahkan 0,3ml reagen E untuk membentuk kompleks warna biru, vortex agar campuran homogen kemudian diinkubasi kembali pada suhu kamar selama 15 menit. Inkubasi yang kedua merupakan waktu dimana campuran protein dengan reagen akan memberikan absorbansi yang maksimum. Kurva baku diperlakukan sama seperti sample. Untuk blanko digunakan aquadest 1,0ml yang selanjutnya diperlakukan sama seperti sample. Fungsi blanko sendiri adalah untuk meng 0 kan spektrofotometer. Larutan blanko merupakan larutan tidak berisi analit yang beperan sebagai larutan pembanding dalam analisa fotometri. Selanjutnya campuran dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500nm dengan menggunakan spektrofotometer visible.

Panjang gelombang 500nm merupakan panjang gelombang maksimal dimana serapan optimal sehingga absorbansi dapat dibaca pada spektrofotometer visible. Dalam praktikum ini digunakan spektrofotometer visible karena larutan yang akan dibaca absorbansinya berwarna.

Prinsip kerja spektrofotometer visible ini adalah cahaya wolfram jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar akan bdipantulkan, sebagian lagi akan diserap dalam medium tersebut dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.

Setelah dihitung kadar sampel x adalah -89,57, kadar sampel y adalah 81,04 dan kadar sampel z adalah 325,63. Kadar sampel x yang negative dapat disebabkan karena kesalahan dalam memipet dan dalam pencampuran.